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【独家】饲用木聚糖酶的酶学性质研究

来源:互联网
日期：2013-10-21
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摘要：采用DNS法对木聚糖酶的一些酶学性质进行了研究。结果表明：该酶的最适反应pH为4.5，在pH3.5~10.0范围内能保持较高的活性。最适反应温度为50℃，热稳定性不高，该酶在动物胃及肠道中活性较高。

关键词：木聚糖酶；酶学性质；稳定性

木聚糖酶(xylanase)是指可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，主要包括外切β-1,4-木聚糖酶、内切β-1,4-木聚糖酶和β-木聚糖酶^[1]。木聚糖酶在饲料、食品、造纸、纺织、医药及能源等领域有着广泛的应用。作为饲用酶制剂，木聚糖酶可以有效消除木聚糖的抗营养作用，促进畜禽对粗饲料的消化吸收；作为新型的纸浆漂白助剂，木聚糖酶能降低漂白用氯，解决纸浆工业中的环境污染问题；木聚糖酶水解植物中的半纤维素，形成的戊糖进一步用于生产木糖醇、酒精、有机酸等产品，在可再生资源生物转化利用中具有重要作用^[2]。

本实验室前期筛选得到了一株高效降解木聚糖的菌株^[3]，本次试验将对该菌株固体发酵产的木聚糖酶进行酶学性质的研究，包括最适反应pH、pH稳定性、最适反应温度、热稳定性及耐受胃蛋白酶胰蛋白酶的能力等进行了测定，以期对该木聚糖酶有更为深入的认识，对该木聚糖酶的应用有一定的指导作用。

1 材料与方法

1.1 木聚糖酶由本实验室固体发酵获得。

1.2 试剂

燕麦木聚糖（X0627）、胃蛋白酶（P7000）、胰酶（T1005）均购自sigma公司。DNS试剂参见GB/T 23874-2009中DNS的配置方法。其余试剂为分析纯。

1.3 酶活测定方法

采用DNS分光光度法测定，具体方法参见GB/T 23874-2009。酶活定义：在37℃、pH为5.50的条件下，每分钟从浓度为5 mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1 μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。

2 试验设计

2.1 木聚糖酶的最适反应pH

分别用0.1 mol/L的不同pH（2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0）的缓冲液（pH≤8.0的用磷酸二氢钠－柠檬酸缓冲液，pH＞8.0的用甘氨酸-氢氧化钠缓冲液）^[4]配制木聚糖底物，按国标测定酶活，以酶活最高者为100%，在其他条件下的酶活占最高酶活的百分数即为在此pH条件下的相对酶活。

2.2 木聚糖酶的pH稳定性

取等量酶液分别加入等量的上述不同pH（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0）的缓冲液，混匀后，在37℃水浴保温4 h，冰水浴冷却后按国标测定酶活。以酶活最高者为100%。

2.3 木聚糖酶的最适反应温度

用最适pH的缓冲液配置溶液，在30、40、45、50、55、60、65和70℃不同的温度下反应，按国标法测定酶活。以酶活最高的温度为最适反应温度。

2.4 木聚糖酶的热稳定性

用最适pH的缓冲液配置溶液，在50、55、60℃不同的温度下处理10、20、40、60、80、100、120 min，按国标法测定酶活。以未处理酶的酶活为100%。

2.5 胃蛋白酶和胰酶对木聚糖酶活性的影响

在0.5 mL木聚糖酶溶液中，分别加入0.5 mL浓度为0.01 mg/mL的胃蛋白酶溶液（用pH2.0，浓度为0.01 mol/L的HCl溶液配置）和0.5mL浓度为0.2 mg/mL胰酶（用pH7.0，浓度为0.1 mol/L的磷酸二氢钾缓冲液配置），在37℃水浴分别处理30、60、90 min，按国标法测定酶活。以未处理酶的酶活为100%。

3 结果与分析

3.1 木聚糖酶的最适反应pH

在不同pH缓冲液中测定酶活力见图1。由图可知，该酶的酶活变化趋势符合钟形曲线。随着pH的升高，酶活呈现上升趋势，在pH4.5时达到最高。随后开始下降，在pH4~5.5之间可保持80%以上的活性。在pH为3.0时仍有50%以上的活性。在pH5.5以后酶活急剧下降，当pH为8.0时酶活仅为最适pH时的7.3%。

3.2 木聚糖酶的pH稳定性

由图2可知，37℃保温4h，该木聚糖酶在pH2.0~10.0之间都具有很好的稳定性。其中在pH2.0~3.5之间，酶活保留率在73.0%~90.0%之间；在pH3.5~10.0之间，酶活保留率在90%以上。

3.3 木聚糖酶的最适反应温度

不同温度下测定木聚糖酶的活性，结果见图3。由图可知，其最适反应温度在50℃，在40~55℃之间可保持有70%以上的酶活，当高于55℃时酶活急剧下降，70℃时酶活仅有1.9%的酶活。

3.4 木聚糖酶的热稳定性

木聚糖酶在不同温度下处理不同时间后的剩余酶活，结果见图4。由图可知，该木聚糖酶的热稳定性随温度的升高呈线性下降。该木聚糖酶在50、60、70℃处理10min后，酶活保留率从92.6%急剧下降至13.6%。该酶在50℃处理120min后，酶活保留率只有67.3%，而在60、70℃处理120min后，酶活保留率分别仅有10.0%和2.5%。

3.5 胃蛋白酶和胰酶对木聚糖酶活性的影响

37℃下用胃蛋白酶和胰酶处理木聚糖酶不同时间后的剩余活性见图5。由图可知，木聚糖酶对胃蛋白酶和胰酶有很好的抗性，经胃蛋白酶和胰酶90min处理后的木聚糖酶酶活分别还剩75%和90%以上，并且在实验条件下胃蛋白酶和胰酶处理时间长短对木聚糖酶的稳定性基本没有影响。

图5 胃蛋白酶和胰酶对木聚糖酶活性的影响

4 讨论

本文研究的该木聚糖酶最适pH值和最适温度与其他关于木聚糖酶的报道相近。pH稳定范围较广，在pH3.5-10.0范围内能保持较高酶活。虽然热稳定不够高，但可通过包被技术使木聚糖酶在制粒的过程中避免酶活损失。该木聚糖酶对胃蛋白酶和胰酶有很好的抗性，较其他报道的木聚糖酶有着巨大的优势^[5]。因此，该木聚糖酶在饲料中的应用具有很好的应用前景。

参考文献：

[1] Christov L P, Prior B. Esterases of xylan-degrading microorganisms: Production, properties and significance[J]. Enzyme Microb Technol, 1993, 15: 460~475.

[2] Viikarii L, Kantelinen A, Sundqvist J et al. Xylanases in bleaching: from an idea to the industry[J]. FEMS Microbiol Rev, 2001, 13: 335~350.

[3] 周平发，王敏，崔细鹏等。饲用木聚糖酶菌株的筛选[J]。饲料与畜牧，2012，4：13~14。

[4] 周先碗。生物化学仪器分析与实验技术[M]。北京：化学工业出版社，2003，316-319。

[5] 杨会涛，陈代文，田刚等。木聚糖酶的酶学性质研究[J]。中国畜牧杂志，2007，43（21）：57~60。

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