单细胞凝胶电泳技术在临床兽医学中的应用

    摘　要：单细胞凝胶电泳技术是一种简便、快速、灵敏的检测真核细胞DNA损伤与修复的方法。其基本原理是将单个细胞包理于琼脂糖凝胶中进行裂解、电泳、荧光染色和显微镜观察，细胞DNA损伤产生的断链或碎片在电泳中迁移形成典型的“慧星”图像，根据迁移长度和荧光强度即可定量分析DNA损伤的程度。该文总结了该实验技术的基本原理、检测方法及其在临床兽医学中的应用前景。

　　关键词：单细胞凝胶电泳；DNA损伤；临床兽医学

　　单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE)是由Ryberg B和Jonhanson K J首先提出[1­2]，后又经Singh N P[3]和Olive P I[4­5]进一步完善的一种在单细胞水平上检测DNA损伤与修复的方法。因其细胞电泳形状颇似彗星，又称慧星试验(comet assay)。它是一种测定和研究单个细胞DNA链断裂的新电泳技术，与传统方法相比，其简便、快速、灵敏、样品量少、无需放射性标记，具有极高的实用价值。目前该技术已广泛地应用于体内、体外各种有核细胞经受试物诱导的DNA损伤和修复的研究。在1999年举行的国际基因毒性检验程序专题学术讨论会中，此方法被定为确定某物质是否具有基因毒性的最佳方法[6]。本文就该技术的原理、操作程序和方法作一简介，并预测其在临床兽医学研究中的应用前景。

　　1　SCGE的原理

　　SCGE是一种在实践中发现的方法，其确切机理目前尚不清楚。一般来说，有核细胞的DNA分子量很大，DNA负超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其他生物膜破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其他成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，惟独核DNA仍保持缠绕的环区(Loop)附着在剩余的核骨架上，并留在原位。

　　如果细胞未受损伤，电泳中核DNA因其分子量大停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。若细胞受损，在电泳液(pH8)中，核DNA仍保持双螺旋结构，偶有单链断裂(SSBs)并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。只有当DNA双链断裂(DSBs)时断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。如果在碱性电泳液(pH＞13)中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中，在电场力作用下细胞核中带负电荷的DNA断链或碎片离开核DNA在凝胶中向阳极移动，形成“彗星”状图像。细胞核DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。因此，通过测定核DNA迁移部分的光密度或迁移长度，就可定量测定单个细胞DNA损伤程度。

　　2　SCGE实验程序和方法

　　至今，SCGE技术在世界上许多实验室应用，操作上进行了许多改良，并不断地融进新技术。但是，最常用的还是碱性SCGE方法，下面就其基本操作程序做简要介绍。

　　2.1　细胞处理

　　细胞在电泳前一般先做DNA损伤的诱导处理，现今有70多种处理剂，如辐射因素、各种氧化剂、烃化剂、抗癌药、诱变剂、农药、重金属、环境因素(烟雾、高温、低温、粉尘等)及药物。处理方式(体内或体外)及处理时间根据实验研究目的而定。

　　2.2　制备细胞悬液

　　从理论上讲，一切活的有核细胞均可进行SCGE实验。细胞可来自人、动物和植物的组织分离细胞或培养的细胞系，分离纯化制成单细胞悬液，用台盼蓝法测定细胞存活率＞95%，细胞密度为1×106个/mL～5×106个/mL，备用。

　　2.3　制片

　　选用的载玻片宜薄不宜厚，单面加水磨沙应均匀细密，铺胶分为3层。第1层，在磨沙面上滴加正常熔点琼脂糖(溶于不含Ca2＋、Mg2＋的PBS液中；56 ℃)，此层的目的是加强凝胶对玻片的附着，防止胶片脱落。第2层为含细胞(约105个)的低溶点琼脂糖(37 ℃)，第3层是不含细胞的低溶点琼脂糖，此层胶的目的是对第2层细胞起保护作用。

　　2.4　细胞裂解

　　移去胶板上的盖玻片，将胶板浸入预冷的裂解液中(2.5 mol/L NaC1、100 mmol/L Na2EDTA、10 mmol/L Tris­HCl、1%肌氨酸钠、用前加1% TritonX­100和10 mL/L DMSO),4 ℃裂解至少1 h，使细胞裂解，DNA松散。

　　2.5　DNA解旋与电泳

　　裂解后取出玻片，用冰冷的PBS缓冲液漂洗3次后置于水平电泳槽内，加入新配制的碱性电泳液(1 mmol/L Na2 EDTA、300 mmol/L NaOH；pH13)至盖过胶面约2 mm～3 mm，使DNA解螺旋20 min(4 ℃)，DNA充分展开，之后，电泳20 min～40 min(25 V,300 mA,4 ℃)。

　　2.6　中和与染色

　　电泳后取出载玻片，用中和液(0.4 mol/L Tris­HCl，pH 7.5)将胶板浸没20 min或滴洗4次，每次5 min。近来有报道中和后再用无水乙醇或甲醇处理，可明显增强DNA的荧光强度，每张胶板上滴加20 mL～100 mL染色剂(如叮啶橙、溴化乙锭、碘化丙锭)，染色2 min～20 min。应尽快阅片，时间过长将导致荧光淬灭。以上各步骤应在黄光或红光下或暗室中操作。

　　2.7　图像分析

　　在荧光显微镜下，观察单细胞电泳图象，每片记数25个～50个细胞，每组2张～3张玻片。观察方法有目镜测微尺直接测量、显微照像后用两脚规测量、图像分析仪进行分析。DNA损伤的测量参数有，尾长(tail lenth)是损伤DNA迁移的长度在低损伤剂量范围内与损伤呈线性关系，尾部DNA密度，与损伤程度有关；尾矩(tail moment)是尾长与尾部DNA百分含量之乘积，在高损伤剂量下与损伤程度呈线性关系；尾块(tail local)是“彗星”尾部分散的大小不一的DNA断片组成，与损伤程度有关；尾惯量(tailinertina)是与每个尾块的面积、平均荧光强度、在X轴上与“彗核”中心距离有关的综合性指标。

　　随着彗星试验方法的不断改进，各种彗星试验试剂盒也应运而生，使试验进一步简化。

　　3　SCGE技术在临床兽医学中的应用前景

　　近年来，SCGE技术在国际上应用发展较快，由于它具有简便、快速、灵敏、需样品量少、适用范围广等优点，预期在临床兽医学研究中(特别是在动物慢性中毒方面)将是一种应用前景十分广阔的新技术。

　　由于工农业的蓬勃发展，环境污染日益严重，动物中毒病时有发生，造成巨大的经济损失。慢性中毒危害严重，不但引起母体慢性中毒，影响其生长发育，而且对胚胎产生毒性造成胚胎死亡、胚胎生长缓慢、胎儿畸形和功能不全。环境污染与DNA损害关系密切，甚至导致癌变、畸胎，日益引起人们的关注。

　　3.1　空气污染

　　二氧化硫(SO2)和粉尘是空气污染中最主要的监测指标。孟紫强等[7]报道SO2能引起小鼠不同脏器(脑、肺、肝、脾、肾、肠和睾丸)及血液淋巴细胞DNA的损伤，且随SO2浓度增加，DNA损伤加剧，并呈明确的剂量­效应关系，随吸入SO2浓度增加，证明SO2是一种全身性DNA损伤因子。粉尘对身体的主要危害是引起尘肺的发生，但粉尘本身的理化性质就可能引起DNA损伤。有研究者[8]报道大气细颗粒物能引起大鼠肺泡巨噬细胞DNA的损伤，并且随着大气细颗粒物浓度的增加及染毒时间的延长而加剧，呈明确的剂量­效应关系和时间­效应关系。

　　3.2　水污染

　　地面水正受到日益严重的污染。在水污染严重的地方，其水生生物的DNA损伤也较对照地区严重[9]。齐宝宁等[10]应用单细胞凝胶电泳和微核试验对污染指数(PI)不同的河流中采集的鲤鱼的红细胞DNA损伤进行测定，发现不同地面水水源中的鲤鱼红细胞DNA损伤情况不全相同，与阴性对照组比较差异有显著性，与污染严重程度呈正相关，结果与微核试验一致。进一步证实通过测定水生生物DNA损伤，可以检测地面水的污染状况。并且蚕豆根尖微核试验可检测染色体水平的损伤，而慧星试验所检测的是DNA链的断裂，所以将这两种试验结合起来，在水环境的遗传毒物生物监测中具有一定的应用前景。

　　3.3　有机试剂污染

　　室内空气污染给人们健康带来的严重危害已受到关注，室内装修所使用的各种装饰材料、油漆及涂料均可释放出大量的苯、甲苯、二甲苯、甲醛、乙醛、丙烯醛及其他各种挥发性有机化合物(VOCs)。特别是甲醛和苯已经成为现代装修后影响室内空气质量的主要污染物。邓艳梅等[11]探讨了空气中的甲醛对遗传物质DNA的断裂损伤作用，发现甲醛能引起肥大细胞DNA断裂，导致DNA­蛋白质交联产生，诱发哮喘的发生。这可能是体内自由基升高，直接氧化肥大细胞和嗜碱细胞，导致细胞膜破裂释放出组织胺，产生过敏反应有关[12]。张美荣等[13]研究发现苯可致小鼠外周血淋巴细胞DNA损伤，明显影响小鼠脾脏、胸腺淋巴细胞DNA和RNA合成而产生遗传毒性作用。这可能是因为苯在体内代谢过程中自由基形成增多，自由基在DNA损伤中发挥重要作用。随着浓度的增高，DNA损伤加重。这也有助于解释苯致白血病的发生。

　　3.4　金属、非金属及其化合物的污染

　　Ge Y M等[14­15]应用SCGE研究了NaF对DNA的损伤作用，以确定氟是否具有遗传毒性，研究发现，NaF对DNA具有损伤作用，并且存在剂量­反应关系，显示氟具有诱变性，可引起染色体断裂，导致染色体畸变；也提示氟可能具有潜在致癌性。这对于在高氟地区进行环境监测提供了新思路。薛莲等[16]应用慧星试验再次证实了镉对中国仓鼠肺成纤维细胞DNA具有明显的损伤作用(出现DNA单链断裂)，其损伤程度随染毒剂量的增加而加重，呈明显的剂量­效应关系，而锌具有明显的颉颃作用。郑玉建等[17]用SCGE法检测氟砷单独及联合对人淋巴细胞DNA损伤作用时，发现砷和氟单独均能引起淋巴细胞DNA单链断裂，并且低剂量氟与砷联合作用时，则呈现协同作用。因此可将SCGE作为一种早期、实用的指标应用于氟、砷及SO2等接触生物群体的DNA损伤监测。

　　4　SCGE技术展望

　　SCGE技术与以往的DNA断裂检测技术相比，具有明显优势。①适用范图广，检测谱宽。与经典的染色体畸变、微核、SCE相比，SCGE适用于体内外各种实验，凡是能制成单细胞悬液的各种真核细胞(包括水生生物细胞、植物细胞等)均可用于SCGE测试。②简便与快速。SCGE法无需复杂的实验技术，所需试剂为实验室常用药品且耗费低，从采样到结果分析只需数小时，为现场调查和大样本量分析提供了可能。③灵敏性好。可以检测到每1.657×10－17kg中0.1个DNA的断裂，甚至检出自然光照射体外淋巴细胞1 h引起的DNA损伤，与SCE、UDS相比具有更高的敏感性，它可能与32P后标记检测DNA加合物的灵敏度一致，被认为是低水平辐射(0.05Gy)检测的快速、敏感方法。④所需细胞样本量少。一般每个样品只需1 000个细胞。⑤与蔗糖密度梯度离心法、DNA碱解螺旋法、中性或碱性滤膜洗脱法、DNA黏度测量法相比，SCGE无需放射性标记，方便易行。⑥本法还能检测非增殖细胞的DNA损伤。单细胞凝胶电泳技术，广阔的应用前景无可非议，方法学自身的拓展方兴未艾，相信该技术将在临床兽医学中得到推广使用。