植酸酶的检测方法

植酸酶的检测方法

　　　　　　　广东温氏食品集团有限公司　　谭宝玲  陈丽  冯建文

摘要：饲用植酸酶酶活性的定量分析至今没有普遍公认的检测方法，本测定方法是在BASF公司1991提出的植酸酶活性的测定方法的基础上进行研究改进，建立了更适合于普通实验室条件下植酸酶产品酶活性的测定。本方法采用绝对法，取二次曲线方程计算，其线性相关性（R²）匀能够达到0.999～1，同一样品同一时间平行测定实验结果相对误差均<2%，同一样品不同时间测定结果相对标准偏差（RSD%）<10%（n=3）。

关键词：  植酸酶    测定方法

植酸酶是催化植酸水解成为肌醇与磷酸的一类酶的总称，其在饲料中的应用得到广泛认同，用于促进畜禽对饲料中多种营养成分的吸收和利用，减少畜禽饲料中植酸磷的排泄，减少环境的磷污染。植酸酶产品的质量鉴定和饲料中植酸酶的添加量是饲料生产厂家和质量检测机构都要面临的工作。商品植酸酶质量及在饲料中的添加量的定量分析至今没有世界公认的测定方法，被广泛认可和使用较多的方法是Gist?brocades和BASF公司1991年提出的植酸酶活性的测定方法，但此方法在操作上仍存在不简便，方法稳定性不够，测定结果误差相对较大。经笔者研究摸索，对BASF公司的植酸酶活性测定方法进行改进，建立了经济、简便、快速、准确度较高、更适合普通实验室的植酸酶产品酶活性测定方法。

1　酶活定义

　　在37.0℃、pH5.50条件下，每分钟从0.005mol/L的植酸钠溶液中释放出1微摩尔的无机磷所需要的酶量，即为1个酶活单位，以FTU/g表示。

2        植酸酶样品

本方法采用的植酸酶样品为本公司购进的罗氏公司乐多仙植酸酶产品和星湖科技公司星湖酶产品，标示量均为≥5000FTU/g。

3　仪器设备                    

3.1　分析天平（精确至0.0001g）

3.2　紫外分光光度计

3.3　恒温水浴锅（能控制在37.0±0.1℃）

3.4　实验室用秒表

3.5　移液枪：0.1～1ml移液枪，2ml移液枪（适配相应枪头）

3.6　磁力搅拌器

3.7　离心机（4000rpm）

3.8　电热恒温干燥箱

3.9　玻璃试管：10ml刻度试管（13Ｘ120mm），试管（18Ｘ180mm）,10ml离心管。

4　试剂与溶液

4.1　醋酸缓冲液（0.25mol/L，pH5.50）：称取三水合乙酸钠30.02g于1000ml烧杯中，加双蒸水约900ml溶解，用冰醋酸调节pH值至5.50±0.05，再加3滴吐温?20，用双蒸水定容至1000ml，摇匀。本溶液最好为现配现用。

4.2　植酸钠溶液（0.00761mol/L，pH5.50）：准确称取植酸钠0.703g（Sigma产品），溶于约80ml醋酸缓冲液中，用冰乙酸或氢氧化钠调pH至5.50±0.03，再用醋酸缓冲液定容至100ml。本溶液临用时新配。

4.3　（1+2）硝酸溶液：1体积浓硝酸与2体积双蒸水混合。

4.4　钼酸铵溶液（100g/L）：取四水合钼酸铵100g，加双蒸水约800ml溶解，加25%氨水10ml，再用双蒸水定溶至1000ml，摇匀。本溶液室温下避光保存，有效期3个月。

4.5　钒酸铵溶液（2.35g/L）：取偏钒酸铵2.35g于烧杯中，加双蒸水500ml溶解，待完全溶解后，搅拌条件下缓缓加入稀硝酸20ml，待冷却至室温后用双蒸水定溶至1000ml。本溶液室温下避光保存，有效期3个月。

4.6　终止液：到钼酸铵溶液和钒酸铵溶液各250ml于1000ml容量瓶中，用（1+2）硝酸溶液定容。本液临用时新配。

5　操作方法

5.1　磷标准溶液及样品溶液配制

5.1.1磷标准溶液：称取基准磷酸二氢钾适量于105℃干燥2h，置干燥器中冷却至室温后，精确称取0.3415g于具塞锥形瓶中，加入约100ml醋酸缓冲液并称量，准确至0.0001g,得25.0055μmol/g磷标准液。用移液器准确移取磷标准液0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.5 g、0.8 g、1 g，置于10ml刻度试管中，加醋酸缓冲液至5g（精确至0.0001g），配制成系列浓度的磷标准液： 0.5001μmol/g、1.0002μmol/g、1.5003μmol/g、2.5006μmol/g、4.0010μmol/g、5.0011μmol/g。备用。

5.1.2　样品溶液：称取1g植酸酶样品于具塞三角瓶中，加醋酸缓冲液至100g并称量（准确至0.0001g），搅拌30min后取上清液于4000rpm离心10min（或用玻璃滤纸过滤），称取上清液0.1g，加醋酸缓冲液稀释至100g，使得到酶活为0.05FTU/g左右的样品溶液，所有称量均需精确至0.0001g。

5.2　酶活反应及测定

称取磷标准溶液、样品溶液、空白醋酸缓冲液各1g（精确至0.0001g）于试管（18Ｘ180mm）中，按表3进行反应。样品反应操作间隔时间为30秒。

表3 反应步骤表

反应完毕后静置10min，再将反应溶液于4000rpm离心10min。取上清液于波长415nm测定其吸收度。根据磷标准液的反应总磷量和吸收度绘制标准曲线并求取二次曲线方程，再根据下式计算样品酶活：

                                  P*F

                 酶活（FTU/g）= ????

　　　　　　　　　　　　　　　　　W*30

式中，P??由样品吸收度根据二次曲线方程求得的反应总磷量，μmol；

W??样品重量，g;

F??样品总稀释倍数；

30??反应时间，s。

6        结果

6.1 方法的重复性

抽取了三个批次的样品，每个样品进行3次不同日期的测定，结果见表1。

           表1  植酸酶产品中植酸酶含量的测定结果

6.2 试验的回收率

取用丹尼斯克提供的液体标准酶产品，酶活性值为6320.0FTU/g，分别取0.5ml标酶进行两次六个平行测定，回收率在100.06～110.92%之间。

7　讨论

7.1 本方法采用称量质量来计算稀释倍数，除去了移液器存在的误差，提高实验的准确性。

7.2在醋酸溶液中可适当加入氯化钙作为表面活性物质，增加酶的活性，对测定结果影响较小，加入量为每1000ml加无水氯化钙0.145g。

7.3实验中水浴的温度是影响酶反应的重要因素，一定要控制好，最好能采用循环水流，振荡水浴亦可，维持水温的均衡。

7.4本方法每次实验均要求在相同条件下同时做标准曲线，否则会增加实验误差。笔者用同一实验数据采用不同的实验标准曲线计算，植酸酶产品酶活性结果可相差976.65FTU/g,标准偏差（RSD%）为16.09%。

参考文献：

1.     GB/T 18634?2002 饲用植酸酶活性的测定-分光光度法。

2.     张若寒，植酸酶的测定方法，中国饲料1997年第5期。

3.     陈小鸽，微量比色法测定饲用植酸酶活力，河南农业科学。