大豆胰蛋白酶抑制因子（TI）的研究进展

大豆胰蛋白酶抑制因子（TI）的研究进展

刘 欣   冯 杰

(浙江大学饲料科学研究所 农业部动物分子营养重点实验室，浙江杭州 310029)

摘要：大豆胰蛋白酶抑制因子是一类小分子量的蛋白质或多肽，对胰蛋白酶活性有抑制作用，摄入过量可导致人和动物患病。因此胰蛋白酶抑制因子被认为是大豆食品和饲料的主要抗营养因子，它的失活能明显提高大豆食品与饲料的营养价值和食用安全性。本文综述了胰蛋白酶抑制因子的结构、基因类型、作用机制、失活及测定方法及其应用前景。

关键词：大豆；胰蛋白酶抑制剂；基因类型；失活；应用前景

大豆胰蛋白酶抑制因子（STI）是大豆中的主要抗营养因子之一。据报道，STI能引起各种动物生长抑制作用如引起老鼠、小鸡的胰腺肿大和增生^[1,2]，还导致仔猪对日粮能量和氮的利用率降低^[3],刺激胰脏蛋白酶和糜胰蛋白酶的合成，增加体液因子（如胆囊激素）的形成和释放^[4]。因此，钝化大豆胰蛋白酶抑制因子对改善和提高大豆食品与饲料的营养价值和食用安全有重要意义。

1．大豆胰蛋白酶抑制因子的结构及其基因类型

1.1大豆胰蛋白酶抑制剂的结构  生大豆中主要有两种胰蛋白酶抑制因子^[5]，一种是库尼兹胰蛋白抑制因子( Kunitz soybean trypsin inhibitor,简称KSTI)，约占1.4％。分子量是21.384KD,内有181个氨基酸残基,含2个二硫键。活性中心是精氨酸63－异亮氨酸64,一个KSTI分子抑制剂能钝化1分子的胰蛋白酶。另一种是鲍曼-贝尔克胰蛋白酶抑制因子(Bowman-Birk soybean trypsin inhibitor ,简称BBI)，约占0.6%,其分子量为7861D,有71个氨基酸残基,7个二硫键,分子中有2个活性中心:1个是赖氨酸16-丝氨酸17,为胰蛋白酶的结合点;另一个是亮氨酸44-丝氨酸45,是胰凝乳蛋白酶的结合点。这两种抑制因子通过结合点的作用与胰蛋白酶络合,从而使胰蛋白酶失活,起到对昆虫、动物及人类的抗营养作用。

1.2大豆胰蛋白酶抑制剂的基因类型  目前研究比较清楚的是Kunitz的基因类型。Kunitz 于1945 年由首先从大豆种子中分离Kunitz 型大豆胰蛋白酶抑制剂SBTI - A2 ,并获得并纯化结晶^[6] 。之后就展开了大量的研究表明:大豆中至少有4 种胰蛋白酶抑制剂,其中最主要的是SBTI - A2^[7] , 属于KTi 型。Singh 等人观察到SBTI - A2 具有电泳变异类型,Hymowitz 等人论证了大豆种子蛋白的提取物经电泳后,出现Rf 值分别为0. 79 、0. 75 、0. 83 三个互为显性的等位基因tia 、tib 、tic ,同时还存在着一种极少量的无SBTi - A2 的隐性等位基因(ti)^[8]。高越峰等(1997 ,1998) ^[9-10]从未成熟大豆子叶中,利用RT - PCR 的方法克隆到了大豆Kunitz 型胰蛋白酶抑制剂基因SKTI ,并采用农杆菌介导转化方法获得了转基因烟草,获得的转基因烟草经抗虫实验表明,具有明显的抗棉铃虫能力,并且通过对照研究表明,SKTI 对胰蛋白酶活性的抑制能力明显高于豇豆胰蛋白酶抑制剂Cp TI。忻骅等(1999) ^[11]克隆了Tid 这个新类型cDNA 全序,并在大肠杆菌中获得了表达,在室内条件下进行了人工饲料喂养,初步研究了其抗虫性。谢可方等^[12]（2002）证明大豆Kunitz 胰蛋白酶抑制剂( SBTi－A2) 大量存在于大豆种子中,属丝氨酸蛋白酶类型抑制剂,它由4个显性等位基因Tia , Tib , Tic及Tid编码, 其中Tid是我国科学家于1991 年从国内15000 余份大豆资源中发现的,它与Tia之间仅有一个氨基酸的差别^[5].这些基因类型的发现，为大豆胰蛋白酶作为生物农药奠定了基础。

2 大豆胰蛋白酶抑制因子的抗营养机理

动物采食大豆日粮后，小肠液中的胰蛋白酶与大豆胰蛋白酶抑制因子结合，生成无活性的复合物，降低胰蛋白酶的活性，导致蛋白质消化利用率下降.同时引起动物体内蛋白质的内源性消耗，肠道中的胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂结合失去活性，反馈性引起胆囊收缩素－促胰酶素（ckk-pz）的分泌增加，ckk-pz刺激胰腺发生补偿性反应，分泌更多的胰蛋白酶补充至肠道，而分泌的消化酶并未用于消化蛋白质，而是继续与STI结合生成无活性的复合物，如此循环，导致蛋白质的内源性消耗。胰蛋白酶中含有丰富的含硫氨基酸，故胰蛋白酶大量补偿性分泌造成体内含硫氨基酸的内源性损失，这加剧了因大豆及其饼粕中含硫氨基酸短缺引起的体内氨基酸的不平衡，引起动物生长受阻或停滞，同时还可引起胰腺增生与肥大。

3 大豆胰蛋白酶抑制剂的失活方法及其检测

3.1胰蛋白酶抑制剂的失活方法

大豆胰蛋白酶抑制因子结构中活性部位的氨基酸是其具有抑制活性的必要条件,所以其中的二硫键受到破坏时能使其失活。近十年来国内外对于大豆胰蛋白酶抑制因子失活方法与技术的研究，主要在物理失活、化学失活、生物学失活等几个方面获得明显的进展。

物理方法包括热失活法、超声波失活法和其他失活法。到目前为止,热处理仍是消除大豆中胰蛋白酶抑制因子的主要方法。其原理是通过加热,破坏饲料中对热不稳定的抗营养因子。马得莹等（2000）^[13]对大豆进行湿热处理，认为在120℃（0.1Mpa）条件下加热10min，大豆中的抗营养因子失活，并且较好地保存大豆的营养价值^[13]。但热处理常常导致其中必需氨基酸(尤其是赖氨酸) 的损失和物料理化性质的改变,从而影响饲料的营养价值。Sessa（1991）^[14]用30mmol的NaS₂O₅65℃处理1h，可使95％的的KSTI和98％BBI失活。但化学失活法难免存在一些化学物质的残留问题,从而影响食品和饲料的安全性。生物技术的迅猛发展为胰蛋白酶抑制因子的失活提供了另一种有效的方法，其原理是胰蛋白酶抑制因子可作为底物而被蛋白酶水解，从而使其活性中心结构改变而失去活性。吴非等（2002）^[15]采用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶钝化大豆胰蛋白酶抑制剂，发现四种酶都能不同程度的钝化胰蛋白酶抑制剂的活性，其中碱性蛋白酶最为显著，使胰蛋白酶抑制剂的活性降为原来的58.09％。采用酶法钝化大豆胰蛋白酶抑制剂，比加热法节省能源，而且还可以改善饲料蛋白的质量。目前主要需要解决的是其应用的成本问题。

3.2大豆胰蛋白酶抑制因子的检测方法

常用来检测大豆胰蛋白酶抑制剂的方法是脲酶检测法。生大豆中的脲酶与胰蛋白酶抑制因子的含量相近，变性失活的程度也与胰蛋白酶抑制因子相似，故可用脲酶活性作为大豆加工适宜程度的检测指标。而氢氧化钾检测法是用来评估大豆加工过度和加工不足的最佳方法。但是这两种方法并不能直接测出蛋白酶抑制因子的含量。所以人们开始尝试用免疫学检测方法来检测胰蛋白酶抑制因子的活性。20世纪80年代Brandon等证明通过酶联免疫吸附测定法可以检测各种大豆产品中的KTI含量。Carter等（1993）尝试用单克隆抗体酶联免疫吸附测定法检测大豆中的胰蛋白酶抑制因子，并绘制了竞争性ELISA曲线。由于杂交瘤单克隆抗体成分比较单一，杂蛋白含量少，重复性好，而且杂交瘤细胞可以长期保存，随时取用，所以具有很广阔的应用前景。

4 大豆资源育种及其前景展望

大豆蛋白是重要的植物蛋白源，其蛋白质含量高达约40％，是联合国粮农组织推荐的21世纪解决人类蛋白质需求的主要食物资源。近年来美国对直接不含胰蛋白酶抑制剂的大豆生粉饲喂畜禽兴趣很高，并收到良好的效果。但是迄今为止,我国尚未发现不含大豆胰蛋白酶抑制剂的基因源,丁安林等(1999) ^[16]年报道了无胰蛋白酶抑制剂的优质大豆新品种中豆28 ,但是它的血缘有来源于美国的大豆品种P. I. L83 - 4387。但同时大豆胰蛋白酶抑制剂还具有重要的防护功能,并且大豆胰蛋白酶抑制剂为含有丰富的含硫氨基酸,降低其含量就会降低其营养性,因此最好的途径是培育或发现无活性胰蛋白酶抑制剂的品种,而不是统统的将胰蛋白酶抑制剂去除,这就需要我们寻找一些大豆胰蛋白酶抑制剂突变新品种。Krishnan(2001) ^{[17 ]}对一份大豆胰蛋白酶抑制剂积累含量很低的大豆品种( P. I. 196168) 做了DNA 序列分析,其编码区发生了两个缺失和G/ T 颠换的突变,这些突变引起4 个终止密码子的引入,导致了不正常的截断的无活性蛋白的形成,Northern 杂交也证明其KTi3 mRNA 积累水平在种子中很低,为我们进一步研究优异的大豆基因源提供了一个很好的借鉴。

参考文献

[1] Rackis J . J , Wolf W. J ,Baker E. C. Protease inhibitions in plant foods :Content and inactivation. In Nutritional \and toxicological Significance of Enzyme inhibitors in Foods [M] .Plenum Publishing :New York ,1986 :299 – 347.

[2] Morgan R. G. H ,Crass R. A ,Oates , P. S. Dose effect of raw soybean folur on pancreatic growth. In Nutritional and Toxicological Significance of Enzyme inhibitors in Foods[M] . Friedman ,M. ,Ed. ;Plenum Publishing :New York ,1986 :81 – 89.

[3] Tamminga S, et al. The nutritional significance ofendogenous N-loss along the gastro-intestinal tract of farm animals[J].Arch Anim Nutr.1995,48,9-22.

[4] Liner I E,Kakade M L. Toxiv Consituents of plant foodstuffs.[M].New york:Academic press,1980.

[5]　庄炳昌主编. 中国野生大豆生物学研究[M].科学出版社,1999 ,144 – 146.

[6]Kunitz M. , Cristallization of a trypsin inhibitor from soybean [J].Science ,1945,101 (2635) : 668 – 691.

[7]刘兴媛,等. 中国大豆种子蛋白中胰蛋白酶抑制剂等位基因的频率及分布[J] 中国油料,1994 ,16 (4) :32～351

[8] Hymowitz T. , Electrophoretic analysis of SBTI - A2 in the USDA soybean germplasm collection [J]. Crop Sci.1973 , 13(4) : 420 –421.

[9] 高越峰,等.大豆Kunitz 型胰蛋白酶抑制剂基因的克隆及其转基因烟草抗虫性初探[J]. 高技术通讯,1997 ,9 :5 – 9.

[10] 高越峰,等. 大豆Kunitz 型胰蛋白酶抑制剂基因的分离及其在抗虫植物基因工程中的应用[J]. 植物学报,1998 ,40(5) :405 – 411.

[11] 忻骅,等. 大豆Kunitz 型胰蛋白酶抑制剂新类型Tid 的全序列分析[J ]. 中国生物化学与分子生物学报,1999 ,15(4) :671 – 673.

[12] 谢可方，等. 大豆kunitz型胰蛋白酶抑制剂的稳定性及抗虫性研究[J]. 复旦学报(自然科学版),2002，12，41(6):631-634.

[13] 马得莹，谢幼梅，曲强. 湿热处理对全脂大豆抗营养因子的影响[J]. 山东农业大学学报，2000，31（2）：166－188. [14] Sessa D L,Nelse T C. Chemical inactivation of soybean protease inhibitors[J]. J Agri Food Chem,1990,38:140-146.

[15] 吴非，霍贵成.酶法钝化大豆胰蛋白酶抑制剂研究[J]. 粮食与油脂，2002，6：9－10.

[16] 丁安林,孙君明. 无胰蛋白酶抑制剂的优质大豆新品种中豆28[J ]. 作物杂志,1999 ,3 :291.

[17] Krishnan H B . Characterization of a soybean [J ]. Plant Sci. 2001 ,160(5) :979 – 9861.