氨基酸微量元素螯合物质量评价方法研究进展

◆作者：张亦菲1   陈剑2   李利3   李相树4

◆单位：1.上海市兽药饲料检测所；2.上海市饲料兽药行业协会；

3.广东省饲料行业协会；4. 山东省饲料行业协会

        摘要：氨基酸微量元素螯合物因其高生物利用度与稳定性，逐渐成为替代传统无机微量元素的重要饲料添加剂。氨基酸微量元素螯合物是可溶性金属盐的金属离子与氨基酸以一定数量的摩尔比共价结合的环状结构产物。氨基酸微量元素螯合物的合成方式及工艺差异较大，产物结构复杂，目前国内外对这类产品的质量仍缺乏统一评价标准。本文系统综述了其质量评价方法研究进展，重点探讨了核心评价指标与检测技术的应用。

        关键词：螯合物；微量元素；质量评价

        微量元素是动物生长发育过程中不可或缺的重要物质。目前饲料中添加的微量元素多为无机物形式，如硫酸铜、硫酸锌等，但传统无机盐在使用过程中存在着消化吸收率低、对动物肠胃刺激大等问题，有机微量元素可显著提高生物利用度（姚小凤等，2023；潘军等，2021；王绍等，2023）。有机微量元素产品根据制备工艺以及参与螯合反应的配体类别进行分类，可分为金属氨基酸络（螯）合物、金属蛋白盐和金属多糖络合物（黄丹萍等，2015）。

        氨基酸微量元素螯合物是可溶性金属盐的金属离子和氨基酸以一定数量的摩尔比（通常为1∶1~3）共价结合的环状结构产物（解成骏等，2019）。氨基酸微量元素螯合物又称氨基酸金属元素螯合物，作为微量元素的有机形态具备多重优势，包括良好的化学稳定性、较高的生物活性以及更易于被机体吸收利用等。当前用于饲料添加剂生产的氨基酸微量元素螯合物多为特异氨基酸螯合物，即使用的螯合剂为畜禽饲养时常用的特种氨基酸，如蛋氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸等。不同生产企业的加工工艺也不尽相同，有较为成熟的液相法、微波固相法、室温固相法，也有针对复合氨基酸螯合物制备的酶解法、酸解法等（任帅等，2017；彭红星等，2022；吴海静等，2021）。因产品结构复杂，更需要对其加强质量控制，以保证在实际生产应用中可以达到预期的使用效果。

        1标准现状

        针对此类产品，我国在2008年发布过一批产品国家标准，并在2017年进行修订后重新发布，如将《饲料添加剂 蛋氨酸锌》（GB/T 21694-2008）修订为《饲料添加剂 蛋氨酸锌络(螯)合物》（GB/T 21694-2017），并增加了螯合率指标。但标准中引用的螯合率测定方法《饲料添加剂 蛋氨酸铁（铜、锰、锌）螯合率的测定 凝胶过滤色谱法》（GB/T 13080.2-2005），已于2017年废止，后续并无替代标准发布实施。2017年之后发布的氨基酸微量元素螯合物饲料添加剂地方标准、行业团体标准中，技术指标已不再要求对产品的螯合率作出具体规定。氨基酸微量元素螯合物的产品标准见表1。

表1氨基酸微量元素螯合物饲料添加剂标准

        近几年发布的检测方法标准见表2。其中2项行业标准规定了测定饲料添加剂氨基酸锌、饲料添加剂氨基酸锰螯合强度的方法，通过使用悬汞电极极谱仪测定特定条件下氨基酸锌、锰的半波电位，利用其和硫酸锌、锰半波电位的差值，来计算络（螯）合强度。行业团体标准则是分别采用滴定法和原子吸收光谱法对总锌、游离锌进行测定。

表2氨基酸微量元素饲料添加剂的测定方法标准

        2质量评价方式

        氨基酸微量元素螯合物制备的方法较多，传统制备技术以液相合成法和固相反应法为主，后又发展出高压流体纳米磨技术、超声化学合成、离子交换膜法和超临界萃取法等（吴海静等，2021）。研究发现，螯合制备参数的变化，会显著影响产物的物理化学性质，如溶解度、晶体结构及产品稳定性等。为更好地对螯合反应及其产物进行控制，需要建立螯合物产品的质量评价方式。行业内常见的质量评价指标有螯合率、稳定常数、螯合强度、螯合纯度等，这些指标的测定方法及优缺点各有不同。

        2.1螯合率

        螯合率常被用来衡量产品中螯合态元素占总元素量的比例，来评价微量元素与氨基酸的螯合程度（吴胜华，2008；胡晓波，2009）。目前已报道的螯合率测定方法有凝胶过滤色谱法、EDTA配位滴定法及离子交换树脂法。其中凝胶过滤色谱法需将样品加热溶解、离心过滤后，根据分子量不同将沉淀态、可溶性的螯合态和游离态的金属离子通过凝胶色谱柱进行洗脱分离，再分别用原子吸收光谱法测定其含量，并进一步计算出相应氨基酸螯合物的螯合率。此方法已被应用于蛋氨酸微量元素螯合物（杨林等，2004）、羟基蛋氨酸系列螯合物（何激进等，2007）等产品的研究中。EDTA配位滴定法则是通过测定乙醇萃取分离前后的总金属离子含量和螯合态金属离子含量来计算螯合率。但螯合物在溶液中的状态并不稳定，测量结果容易有所偏差。

        2.2稳定常数

        稳定常数（Kf）可用来反映螯合物产品中已经螯合部分的稳定程度。因稳定常数一般指浓度稳定常数，所以稳定程度多指螯合物在溶液中的稳定性。稳定常数的主要影响来自配位体的特性，同一种氨基酸与不同微量元素形成的螯合物，稳定常数也各不相同（冯定远等，2017）。目前市场被广泛应用的氨基酸微量元素螯合物，其稳定常数大多在3-10（许甲平等，2017），研究资料显示，稳定常数过低或过高都不利于动物机体的吸收， 3-10是个适宜动物吸收利用的稳定常数范围（鲍宏云等，2012）。稳定常数的测定方法主要有紫外分光光度法、极谱法和pH电位法等（冯颖等，2020；洪作鹏，2006）。稳定常数在配体单一的螯合物产品质量控制中较为适用，对于多肽螯合物等组成较为复杂的氨基酸螯合物，因溶液中配位体浓度和配位数难以准确确定，因此稳定常数的测定也会受到影响（黄丹萍等，2015）。

        2.3螯合强度

        螯合强度（Qf）是指螯合剂与金属离子形成稳定螯合物的能力。Holwerda等1995提出可通过电化学方法（即极谱法）测定络合态和非络合态金属离子的半波电位差进行检测，并应用于矿物元素金属蛋白质盐的螯合强度测定，该方法也可用于测定成分较复杂的螯合物产品（如蛋白质螯合微量元素或肽类螯合微量元素）（曹冬梅等，2010）。但螯合强度的测定也有其局限性，如只可用于测定饱和溶液，不能得出游离态和络合态元素的比例（冯定远，2014）。

        2.4螯合纯度

        螯合纯度指有机微量元素中螯合的部分占总物质含量的百分比，将螯合物纯度和螯合率这两个概念做了结合，来评价有机微量元素质量的好坏（周建群等，2014）。螯合纯度需要分别计算螯合率和纯度，再将两者的结果相乘。各组分计算的方法保证了计算时是组成有机螯合物各成分含量总和，解决了螯合率仅用金属离子作为检测依据的局限性。但此类方法适合于组分相对简单、产品本身纯度较高的产品，适用范围有限。

        3检测方法的应用

        除了上述质量评价方式中涉及的检测方法，还有很多检测方法被广泛应用于研究氨基酸微量元素螯合物的结构表征，在氨基酸螯合物生产工艺研究中对产物进行定性分析，以确认最佳合成条件。

        3.1红外光谱法

        红外光谱法可研究目标化合物的结构及化学键。不同化合物的特征基团在一定波长会产生吸收峰，化学键不同其红外光谱吸收峰的位置和峰型也各不相同。通过螯合反应，金属离子与氨基、羧基等基团发生反应会导致其红外光谱中吸收峰发生迁移，反映出化合物分子结构的变化。如通过比较纯甘氨酸与甘氨酸金属螯合物红外光谱图，发现氨基（N-H）和羧基（C=O）的吸收峰发生较大漂移并形成了其他特征吸收峰，以判断甘氨酸与金属离子形成了配位键，从而证明了螯合物的形成（许甲平，2014；管海跃，2007）。对于复杂成分的金属蛋白质螯合物，红外特征吸收峰的位置、强度、形状变化等特征频率变化可反映其官能团振动频率的变化（WANG X，2017）。

        3.2拉曼光谱法

        拉曼光谱法是一种基于光与被测物质内化学键的相互作用的分析技术。拉曼光谱法可测得样品的结晶度、化学结构等信息，可作为红外光谱法测定结果的有效补充，进一步证明氨基酸与金属离子发生了螯合反应（彭红星等，2022）。

        3.3 X射线衍射法

        X射线衍射法可通过晶体变化来分析物质空间结构的变化，可以作为氨基酸微量元素螯合物的定性分析补充手段，分析螯合物晶体结构（王晴晴等，2024）。通过X衍射图谱的峰形、峰位及强度，判断螯合物产品的结晶程度和纯度（周建群等，2015）。判断产物中的氨基酸是否与金属离子发生螯合反应，一方面可比较氨基酸与氨基酸螯合物产物的X衍射图谱重衍射峰信息，另一方面也可通过软件根据目标氨基酸金属螯合物的晶体结构数据拟合图谱，与实际螯合物产物图谱进行对比，判断产物与晶体结构是否一致（彭红星等，2022）。

        3.4紫外分光光度法

        金属离子与氨基酸发生螯合反应，会使配位体对光吸收性能发生改变。根据其原理，可以对氨基酸、氨基酸螯合物溶液进行紫外全波长扫描，通过比较最大吸收波长是否发生位移或发现新的吸收峰产生来证明螯合反应的发生。如通过紫外分光光度法可分别测定赖氨酸、赖氨酸铜和赖氨酸锌的水溶液，结果显示三种产品的最大吸收峰均不相同（刘飞飞等，2019），测定蛋氨酸及蛋氨酸铜水溶液，蛋氨酸的最大吸收峰在215nm处，而蛋氨酸铜的吸收波长为210和232nm（李放等，2018）。紫外分光光度法与其他检测方法相比更为简单、快捷，但看不到特定官能团的峰值变化，要证明螯合反应的效果还需要辅以其他检测方法的测定结果。

        4生物学分析方法的应用

        微量元素氨基酸螯合物因其独特的环状结构，相较无机盐类和简单有机盐类微量元素等饲料添加剂具有更高的生物学效价，即被动物吸收后的营养素可被有效利用的比例更高，包括消化率、代谢吸收率、有效性等，也被称为生物学利用率（虞俊翔等，2015）。随着对微量元素氨基酸螯合物研究的持续发展，生物学效价被作为一种评价螯合物产品质量的指标，与化学分析相结合为螯合物在生物体内的代谢路径及功能机理的研究提供生物学依据。

        生物学效价的评价是动物营养学、饲料科学及生物医学领域的重要研究内容，方式一般有参比法、同位素示踪法和平衡试验法，可通过生产性能指标、外观指标、血液学参数指标和部分发育参数指标等参数进行评定。参比法可通过斜率比法、标准曲线法、三点法等方式计算相对生物学效价，通常需选取一类性质稳定且被广泛添加的物质作为标准物，如硫酸锌、硫酸铜等（周锦兰等，2002；吴学壮等，2015）。因标准物、研究物的添加量会对指标参数的数值产生线性的影响，可通过比较标准物、研究物添加后的效果得到相对生物学效价。如开展硫酸亚铁、赖氨酸螯合铁和甘氨酸螯合铁在大鼠体内的吸收研究，就可根据大鼠机体中血红蛋白、血清铁、总铁结合力和血清铁蛋白等血液指标为判断依据进行分析比较（周桂莲等，2002）。同位素示踪法是通过测定标记的微量元素在动物体内组织中的含量来测定生物学效价，该方法灵敏度高，可测定真吸收率，可反映微量元素进入动物机体后的转运、分布情况，但由于使用该法的饲料成本和设备需求很高，应用并不多见。平衡试验法则是通过测定一定时间内动物摄入和排出的被测元素量来计算其吸收和利用率，是一种原理和所需设备都相对简单的传统方法，但由于在实际实验过程中，实验动物摄入的微量元素及排泄物中的量都难以准确测定，数据误差较大，难以广泛用于测定螯合物生物利用率。

        5检测方法联用

        氨基酸微量元素螯合物的结构复杂，现有的研究无论是对其生产制备工艺还是对产品质量评价，都无法仅通过一种分析方法给出直接的、准确的结论，但可通过多种分析手段实现对产品的多维度评价。如对螯合物产品进行分离纯化，可先后通过膜分离系统和凝胶层析手段实现（燕会等，2017）；对产品进行结构解析，可利用红外光谱分析化学键和官能团的变化，紫外光谱可用于推断结构变化，质谱则用于确定产品的分子量和氨基酸序列（梅洁等，2024）或总金属量（王真等，2020），还可通过扫描电镜、EDS能谱、Zeta电位、粒径分析、热重分析等检测技术，掌握螯合反应后产物性质的变化（黄磊等，2025）。多维度的检测分析手段有效避免了单一检测方法带来的局限性，为螯合物形成机制及结构特征的研究，提供了可靠的方法框架。

        6存在问题与展望

        目前对于氨基酸微量元素螯合物质量评价研究的问题主要集中在以下几个方面：工艺控制方面，因螯合反应会受到pH、温度、原料配比等诸多因素的影响，工艺过程中的微小变化也可能导致产品批次间产生显著差异，螯合物产品在储存、加工或体内环境中的稳定性研究不足，产品的质量控制缺少可靠数据。质量控制方面，氨基酸微量元素螯合物作为饲料添加剂在使用时，复杂的饲料样品基质对检测结果会产生一定影响，如稀释剂和载体会对红外光谱或紫外光谱的分析结果产生干扰，影响定性结果准确性。另外，氨基酸中的配位基团与金属离子的结合模式复杂，红外光谱虽能分析官能团变化但无法明确螯合位点的具体配位方式，传统的光谱分析技术存在局限性。检测方法标准化方面，目前氨基酸螯合物的质量评价方法差异较大，企业采用的检测手段参差不齐，行业内缺少统一的评价标准。

        基于当前氨基酸微量元素螯合物质量评价研究所面临的方法碎片化、技术局限性和标准化缺失等困难，亟需通过多维度技术联用、人工智能辅助分析及标准化评价体系建立，构建从分子结构、螯合机制研究到生物功能的全链条评价体系。推动螯合物在畜牧、食品、医药等领域的安全、高效应用。

        参考文献：（略）